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行政院院長時期
2005年12月3日，因民進黨於三合一選舉大敗，而依黨內慣例辭去黨主席職務。陳水扁總統在2006年1月19日任命蘇貞昌為行政院院長，接替因高捷弊案導致民進黨縣市長選舉大敗而請辭的謝長廷。1月25日正式上任。
在2007年5月6日舉行的2008年中華民國總統大選民進黨黨內初選中，蘇貞昌在第一輪以33.40%的得票率落後給謝長廷的44.66%，蘇貞昌和另外兩名參選人隨即宣布放棄第二輪初選，由謝長廷出線。
泛綠一般認為，蘇貞昌會落選的原因在於與新潮流系關係過好，新潮流系雖然被外界視為黨內的改革派，並屢屢針對民進黨狀況提出興革意見，但是民進黨其餘黨內人士則認為新潮流系經常與泛藍一起批評深綠政治人物，引起深綠支持者普遍不滿，初選不願意支持蘇貞昌。
蘇貞昌在黨內初選階段與謝長廷劍拔弩張，他直言批評謝長廷從主張「憲法一中」改口「主張憲法一中是為了廢除憲法一中」立場反覆；蘇貞昌並公開質疑謝長廷涉及高捷弊案，要求謝長廷應針對相關涉案事實清楚說明：「轉移焦點，不能移轉涉案事實。」蘇貞昌在立法院備詢時，影射謝長廷「奸巧」並且直指謝說謊。而謝亦反擊蘇，謝蘇的黨內初選，被媒體形容為「刀刀見骨」。
2007年5月12日，蘇貞昌宣佈辭去行政院院長職務，獲總統陳水扁批准。
